Пробирка

Чем сильнее эмбриология в клинике, тем результативнее исходы эко. Данный этап мы с вами контролировать не в состоянии. Эмбриологическое отделение в клинике эко - это святая святых.

Тем не менее, весьма интересно узнать, что же происходит с нашими клетками после пункции и в каких условиях.

Разные клиники эко в силу своих финансовых и технологических возможностей используют различные среды разных производителей. Возможно, применение тех или иных сред для культивирования оказывает значительное влияние на результативность эко.

Культуральная среда

Должна быть максимально приближена по всем параметрам к естественным жидкостям, в которых ооциты и эмбрионы находятся в организме женщины при естественном зачатии.

Основные характеристики среды

    * уровень PH должен равняться 7,4 что соответствует рн крови. Для определения рн среды используется цветной индикатор, при котором среда для культивирования приобретает характерный красно -оранжевый цвет.

    * осмолярность, определяемая концентрацией и констанциями диссоциации ее компонентов, =285 мОсм/кг воды и соответствует таковой крови.

    * качество воды

      для питательных сред используется вода после двойной дистилляции, ультрафильтрации или ионизации. Оптимально при приготовлении сред напосредственно в лаборатории закупать воду только у производителей, гарантирующих высокий уровень ее качества ( фирм Sigma, Ampuwa)

    * ионный состав

      Наиболее часто в качестве источника белка используется бычий или человеческий сывороточный альбумин, а также инактивированная человеческая сыворотка. Могут быть добавлены в среды и аминоксилоты, что объясняется их присутствием в жидкости яйцеводов некоторых млекопитающих. Однако не все аминокислоты остаются стабильными в условиях культивирования. При температуре 37 градусов происходит их разрушение с выделением токсических продуктов распада.

Помимо кислот, среды могут содержать витамины, нуклеотиды, микроэлементы.

СО2 культиватор

Культивирование ооцитов и эмбрионов человека производится в присутствии 5% СО2 в воздухе при температуре 37 градусов и влажности 80-90%. Эти условия соблюдаются при использовании СО2 инкубаторов, поддерживающих необходимую температуру, влажность и уровень СО2 в камере, который поддерживается в камере посредством подачи углекислого газа из баллона, где он находится в сжиженном состоянии, и из воздуха из окружающей среды. Влажность поддерживается постоянным испарением воды со дна камеры либо из специального лотка. В некоторых современных камерах имеется система инжекции воды в циркулирующий воздух, автоматически поддерживающая влажность в камере до 90%.

Оценка качества ооцитов

Во время пункции фолликулов с фолликулами попадают ооцит-cumulus вместе с частью фолликулярного эпителия. Фибриноген, содержащийся в фолликулярной жидкости приводит к образованию сгустков, которые затрудняют обнаружение ооцита. Поэтому после пункции ооциты промывают или фолликулярную жидкость собирают в пробирки с гепарином (антикоагулянт).

Фолликулярная жидкость просматривается на присутствие комплексов ооцит-cumulus и переливается в чашку Петри диаметром 9 см. просматривается под микроскопом. Ооциты видны невооруженным глазом как блестящие слизистые комки 0,5-1 см.

Найденные ооциты помещают в среду для отмывки, отмываются и помещаются в лунку 4-луночной чашки (либо специальная чашка), где будет производиться оплодотворение.

Манипуляции с ооцитами проводят с помощью стерильных пастеровских пипеток, имеющих небольшую резиновую грушу на конце, либо стеклянных(пластиковых ) капилляров, присоединенных к микроаспиратору (зависит от предпочтений эмбриолога).

После помещения в культуральную среду делают первичную оценку количества, качества и степени зрелости полученных ооцито - cumulus. Оценка степени зрелости ооцитов по состоянию комплексов ооцитов - cumulus весьма субъективна и часто не соответствует истинному состоянию ооцита.

Асинхронность созревания ядра ооцита, ооплазмы и клеток cumulus часто встречается в циклах ЭКО.

Зрелый ооцит- 110-120 мкм в диаметре, окруженный блестящей оболочкой (zona pellucida), несколькими клетками лучистого венца (corona radiata) и большим числом клеток яйценосного бугорка(cumulus oophorus). В ооците , как правило, завершилось первое деление мейоза ( в результате - отделение первого полярного тельца), а второе - в стадии метафазы. Хромосомы располагаются в ряд, образуя метафазную пластинку, непосредственно под полярным тельцем. На этой стадии в ооците происходит блок мейоза. который снимается лишь при проникновении сперматозоида.

Обработка спермы перед ЭКО

Зрелый сперматозоид с уплощенной грушевидной головкой длиной около 6 мкм и шириной в экваториальном сегменте около 4 мкм. состяощую из ядра и акросомы, содержащей литические ферменты и расположена в виде шапочки над верхней половиной головки. Хвот имеет длину около 50 мкм и начинается от головки в районе шейки, где расположен центриоль и комплекс митохондрий.

Оплодотворение ооцитов

Прежде чем попасть в ооцит, сперматозоид преодолевает несколько препятствий:

-cumulus, по мере продвижения внутрь cumulus поведение сперматазоида резко меняется: резко возрастает скорость, наступает фаза гиперактивности;

-достигает zona pellucida,где происходит его связывание с рецептором.

Затем происходит акросомная реакция - мембрана акросомы и цитоплазматическая мембрана ооцита сливаются, содержимое акросомы выбрасывается в месте связывания с zona pellucida и спематозоид продвигается сквозь оболочку ооцита, все еще находясь в фазе гиперактивности.

Попадая в пространство между zona pellucida и мембраной ооцита сперматозоид прикрепляется к рецепторам на мембране ооцита рецепторами на экваториальной части головки под акросомой, что вызывает кортикальную реакцию, приводящую к необратимым процессам zona pellucida, делающим ее непроходимой для других сперматозоидов. Через несколько часов генетический материал обеих гамет сливается , возникает зигота, и хромосомы подготавливаются к первому делению дробления.

На следующий день ооциты переносят в лунку со свежей средой и под микроскопом смотрят на предмет оплодотворения.

Пронуклеусы появляются через 10-16 часов после добавления сперматозоидов иисчезают через 6-8 часов после появления. Если их не удается обнаружить -оплодотворение не состоялось. Если виден один пронуклеус либо больше двух-произошло аномальное оплодотворение.