Пробирка

Один из самых важных этапов в программе ЭКО – эмбриологический. Именно от того, как будет выполнена оценка качества и оплодотворение яйцеклетки, а также последующее культивирование до созревания эмбрионов,  во многом зависит успешный результат экстракорпорального оплодотворения.

Успех определяется опытом конкретного эмбриолога, и контролю этот этап не поддаётся. Но при этом многим женщинам будет очень полезно узнать, как осуществляется оплодотворение яйцеклетки и культивирование до стадии эмбрионов.

Клиники по лечению бесплодия применяют для этой цели различные среды, и зависит это, в первую очередь, от бюджета и технологической оснащённости.

Культуральная среда

Требования, предъявляемые к культурной среде, используемой в ЭКО,  весьма серьёзные: её показатели должны максимально совпадать с параметрами, которыми обладает естественная жидкость, служащая средой для эмбрионов и яйцеклеток в женском организме.

Основные характеристики, которыми должна обладать среда:

- уровень РН – 7,4. Точно таким же уровнем РН обладает кровь человека. Определить РН можно с помощью цветного индикатора, который должен окраситься в красно-оранжевый цвет;

- осмолярность, равная 285 мОсм/кг воды. Она также соответствует осмолярности, которой обладает кровь;

- вода, используемая для приготовления питательной среды, должна пройти двойную дистилляцию. Идеальный вариант, который практикуют многие центры по лечению бесплодия – приобретение воды у известных производителей, которые гарантируют высокое качество своей продукции, например, у компаний Ampuwa, Sigma;

- ионный состав.

Обычно в качестве источника  белка  в циклах ЭКО используют человеческий или бычий сывороточный альбумин, либо инактивированную сыворотку человека. В среду иногда добавляют аминокислоты, поскольку они имеются в яйцеводах представителей некоторых семейств млекопитающих. Но стабильность в условиях культивирования проявляют далеко не все аминокислоты. Как только температура среды достигнет 37 градусов, они распадаются, выделяя при этом токсические элементы.
Кроме того, питательные среды, используемые при экстракорпоральном оплодотворении,  могут включать в себя нуклеотиды, витамины и микроэлементы.

СО2 культиватор

Для культивирования яйцеклеток и эмбрионов в циклах ЭКО необходимо наличие в воздухе 5% СО2, влажность не менее 80% и не более 90%,  а также температура 37 градусов. Наиболее оптимального соотношения этих показателей можно достичь, применяя СО2 инкубаторов, в которых автоматически поддерживаются требуемые показатели. Углекислый газ подаётся из специального баллона и из окружающего воздуха, требуемая влажность достигается с помощью испарения воды.

Оценка качества ооцитов

В тот момент, когда в процессе ЭКО осуществляется пункция фолликулов, вместе с ними нередко захватываются и ооцит-cumulus, иногда и с частицами фолликулярного эпителия. Поскольку в фолликулярной жидкости содержится фибриноген, это может способствовать формированию сгустков, осложняющих  выявление яйцеклетки. Чтобы упростить процесс, ооциты, полученные в результате пункции, промывают, либо помещают фолликулярную жидкость в контейнер с антикоагулянтом (гепарином).

Фолликулярную жидкость проверяют на наличие в ней сгустков яйцеклеток-cumulus, затем переливают её в чашку Петри и проверяют  ещё раз, но уже под микроскопом. Как правило, яйцеклетки можно разглядеть невооружённым глазом, выглядят они в виде слизистых сгустков размером 5-10 мм.

Обнаруженные ооциты отмывают в специальной среде, а затем перекладывают в специальную чашку, где будет осуществляться оплодотворение яйцеклетки. Для этого используются пастеровские пипетки с маленькой резиновой грушей на конце или же капилляры из стекла или пластика, которые подсоединяют к микроаспиратору. Выбор инструментария зависит от самого эмбриолога, осуществляющего искусственное  оплодотворение яйцеклетки.

После того, как ооциты помещены в культуральную среду, специалист предварительно оценивает их качество, количество и степень зрелости. Причём комплексы ооцитов – cumulus не всегда позволяют дать истинную оценку яйцеклетки.

В циклах экстракорпорального оплодотворения зачастую отмечаются отсутствие синхронности в созревании ядер ооплазмы, самой яйцеклетки и клеток cumulus.

Показатели абсолютно зрелой яйцеклетки таковы: диаметр – 110-120 мкм, ооцит должен быть окружен блестящей плёнкой (zona pellucida), несколькими клетками лучистого венца (corona radiata) и  множеством клеток яйценосного бугорка(cumulus oophorus).

В пунктированной яйцеклетке должно быть закончено  первое деление мейоза, в результате которого первое полярное тельце отделяется. Второе деление, как правило, находится в стадии метафазы. Хромосомы образуют ряд, создавая тем самым метафазную пластинку, располагающуюся прямо над полярным тельцем. При этом в яйцеклетке осуществляется блок мейоза, снять который способен лишь сперматозоид, проникший сквозь оболочку.

Обработка спермы перед ЭКО

У зрелого сперматозоида имеется грушевидная головка, слегка уплощённая, размеры её достигают в длину примерно 6 мкм, а в ширину, в районе экваториального сегмента – 4 мкм. Состоит головка из ядра и акросомы, которая включает в себя литические ферменты. Она напоминает шапочку и располагается над верхней частью головки. Размер хвоста сперматозоида достигает в длину примерно 50 мкм. Хвост берёт своё начало от головки, примерно в области шеи, там же находится комплекс митохондрий и центриоль.

Оплодотворение яйцеклетки

Сперматозоиду, перед тем, как  проникнуть в ооцит, следствием чего становится оплодотворение яйцеклетки, предстоит преодолеть ряд препятствий:

1) cumulus. Проникая в него глубже, сперматозоид увеличивает свою скорость, демонстрируя фазу гиперактивности.

2) zona pellucida. Здесь сперматозоид связывается с рецептором.

После этого осуществляется акросомная реакция, в процессе которой цитоплазматическая мембрана и мембрана акросомы объединяются. Содержимое акросомы затем выбрасывается,  связывается с zona pellucida, затем сперматозоид проникает через оболочку яйцеклетки, не теряя своей активности.

В том месте, которое располагается между оболочкой  яйцеклетки и zona pellucida, сперматозоид присоединяется своими рецепторами к рецепторам, которые располагаются на оболочке яйцеклетки. Это способствует возникновению кортикальной реакции, которая становится причиной необратимых процессов zona pellucida, что  делает её недоступной для проникновения других сперматозоидов. Спустя несколько часов, обе гаметы объединяют свой генетический материал, в результате чего появляется зигота. Хромосомы начинают готовиться к процессу первого деления дробления.

Спустя сутки, ооциты помещают в лунку, наполненные свежей культуральной средой, определяя, произошло ли оплодотворение яйцеклетки.

После того, как туда будут добавлены сперматозоиды, появятся пронуклеусы (это происходит через 10-16 часов). Ещё через 6-8 часов они бесследно исчезнут. Важно вовремя заметить их, поскольку именно их появление говорит о том, что оплодотворение яйцеклетки состоялось. В случае, если наблюдается один пронуклеус, или же более двух, то это говорит о развитии в процессе ЭКО аномального оплодотворения яйцеклетки.